용리액의 최적화

1. 중성화합물의 경우

중성화합물의 분리는 이동상의 pH값과 첨가물의 영향을 거의 받지 않으므로 [물과 수용성 유기용매의 혼합용액(주)]이 최적의 용리액입니다.

(주) 수용성 유기용매에는 acetonitrile, 메탄올, 에탄올 또는 2-프로판올을 사용하십시오.

먼저, CHIRALPAK AD-RH, CHIRALCEL OD-RH는 [물/acetonitrile = 60/40 (v/v)], CHIRALCEL OJ-RH는 [물/acetonitrile = 70/30 (v/v)]을 테스트하십시오.
그 결과, AD-RH, OD-RH, OJ-RH모두, 다음과 같은 검토를 하십시오.

(1) 보호유지가 약하고 분리가 잘 안되는 경우
→ 칼럼의 온도를 내린다
→ 유기용매 비율을 내린다.

(2) 보호유지가 너무 강해서,
화합물의 용출이 안되고 단시간에 분석하고싶을때는
→ 칼럼의 온도를 올린다.
→ 유기용매 비율을 올린다.

2. 산성화합물의 경우

산성화합물의 분리는 소량의 강한산을 첨가하고 샘플의 이온화를 억제하는것이 효과적이므로
[저농도의 강한 산 수용액과 수용성유기용매(주)의 혼합용액]이 최적인 용리액입니다.

(주) 수용성 유기용매에는 acetonitrile, 메탄올, 에탄올 또는 2-프로판올을 사용하십시오.

먼저, [pH2.0의 인산수용액 / acetonitrile]
(CHIRALPAK AD-RH, CHIRALCEL OD-RH는 용매비율 60/40 (v/v), CHIRALCEL OJ-RH는 70/30)
또는 [pH2.0의 인산완충액 / acetonitrile]
(CHIRALPAK AD-RH, CHIRALCEL OD-RH는 용매비율 60/40, CHIRALCEL OJ-RH는 70/30)으로 테스트 하십시오.

용리액 pH값의 영향
flurbiprofen을 예로 용리액으로 pH2.0~7.0의 인산 완충액과 acetonitrile의 혼합용매를 사용해서 광학이성체의 분리를 해 보았습니다.
그림 5-1은 관찰되는 용리액의 각 pH(횡축)과 각 에넌치오머의 k' (보호유지계수) 종축 의 관계입니다.

이동상:50mM인산 완충액/acetonitrile=60/40 , 유속:0.5ml/min., 칼럼온도:25도, 검출:UV(254nm)
이동상의 pH와 보호유지계수

그림 5-1 산성화합물의 분리에 대한 용리액의 pH의존성

→ pH값이 낮을수록 보호유지가 강하고 분리도 잘된다
→ pH값이 높을 수록 보호유지가 약하고 분리도 안좋다

이 그래프의 형태는 S자형 커브입니다.
pH값이 낮은 용리액중에 flurbiprofen의 카르복실기의 이온화가 억제되어 분리되기 어렵기 때문에 용질의 분배가 고정상측에 향하고 보호유지가 강해진다고 추정됩니다.
즉 산성화합물을 효과적으로 분리하기위해서는 분리할 화합물의 이온화를 억제하게끔 용리액의 pH값을 낮게 조정하는 것이 중요합니다.

3. 염기성 화합물의 경우

(1) CHIRALPAK AD-RH의 경우

산성화합물과는 역으로 용리액의 pH값을 올리고 샘플의 이온화를 억제하는것이 효과적입니다.
따라서 [저 농도의 염기성완충액과 수용성 유기용매(주)의 혼합용액]이 최적인 용리액입니다.

(주) 수용성 유기용매에는 acetonitrile, 메탄올, 에탄올 또는 2-프로판올을 사용하십시오.

먼저, [20mM인산완충액(pH8.0) / acetonitrile = 60/40 (v/v)을 테스트해 보십시오.

완충액 조제에 사용되는 염의 종류와 영향

alprenolol염산염을 예로 용리액으로 염기성완충액과 acetonitrile 의 혼합용액을 사용해서 광학이성체의 분리를 실험했습니다.
인산완충액
(KH2P04-Na2HP04)
붕산완충액
(H3B03-Na2B407)
이동상:20mM완충액(pH9.0) / acetonitrile = 60/40(v/v), 유속:0.5ml/min., 온도:25도, 검출:UV(220nm)

그림 5-2 alprenolol염산염의 분리에 대한 완충액 조제에 사용되는 염의 종류와 영향

완충액 조제에 사용되는 염의 종류에 따라 보호유지시간이 틀리고 보호유지가 강할 수록 좋은 분리가 됩니다.
즉 보호유지 및 분리는 완충액 조제에 사용되는 염의 종류에 따라 영향을 받습니다.

용리액 pH값의 영향

alprenolol염산염을 예로 용리액으로 pH6.0~10.0의 인산완충액과 acetonitrile 의 혼합용매를 사용해서 광학이성체 분리를 테스트 했습니다.
그림 5-3은 그 결과를 관찰 용리액의 각 pH(횡축)과 각 k'(보호유지계수)(종축)의 관계입니다.
이동상:20mM인산완충액 / acetonitrile = 60/40(v/v), 유속:0.5ml/min., 온도:25도, 검출:UV(220nm)

그림 5-3 염기성화합물의 분리에 대한 용리액의 pH의존성

→ pH가 높을 수록 보호유지가 강하고 분리도 좋다
→ pH가 낮을 수록 보호유지가 약하고 분리도 나쁘다
pH값이 용리액중에 alprenolol염산염의 아민기의 이온화가 억제되기 때문에 용질의 분배가 고정상측에 향하고, 보호유지는 강해진다고 추정됩니다.
즉 염기성 화합물을 효과적으로 분리하기위해서는 분리할 화합물의 이온화를 억제하게끔 용리액의pH값을 높게 조정하는 것이 중요합니다.
pH값을 너무 높게 하면 베이스에 있는 실리카겔이 손상되어 단수저하나 피크가 왜곡되는 원인이 되므로 pH값을 조정할때는 충분하게 주의를 하십시오.

(2) CHIRALCEL OJ-RH 및 OD-RH의 경우

염기성 화합물의 분리는 핵산플로오로인산칼륨등의 염을 첨가하고 이온페어크로마트그래피 를 이용하면 효과적입니다.
따라서 [핵산플로오로인산칼륨등의 염수용액/수용성유기용매의 혼합용액]DL 최적인 용리액입니다.
먼저, 0.1M핵산플로오로인산칼륨/acetonitrile]
(OJ-RH의 경우 70/30(v/v)의 혼합비율)을 테스트하십시오.

첨가할 염의 종류와 영향

나프틸에틸아민을 예로, 용리액으로 염수용액과 acetonitrile의 혼합용액을 사용해서 광학이성체분리를 테스트했습니다.

그림 5-4 나프틸에틸아민의 분리에 대한 각종 첨가 아니온의 영향(CHIRALCEL OJ-RH)

첨가할 염의 종류에 의한 광학이성체 분리에 대한 효과가 틀리고 핵사플로오로인산염이 가장 양호한 분리효과를 나타냈습니다.
역상계이온페어 크로마트그라피로 일반적으로 많이 사용되는 장쇄alkyl sulfonic acid염은 보호유지를 높이는 효과가 있지만,
광학이성체의 분리에 대한 효과는 바랄 수 없습니다.
그리고 일반적으로 염농도가 높을 수록 보호유지가 강해지고 분리도 잘됩니다.
그러나 고농도는 에서는 피크가 넓어지고 분석시간이 길어지기때문에 염기성화합물을 효과적으로 분리하기위해서는 맞는 염의 농도를 선택하는것이 중요합니다.